Premessa

L’introduzione in Italia della Legge 19 febbraio 2004, n. 40, ha introdotto il divieto di crioconservare embrioni e di “creare un numero di embrioni superiore a quello strettamente necessario ad un unico e contemporaneo impianto, comunque non superiore a tre”.⁽¹⁾

Gli studi in medicina della riproduzione mostrano che sebbene la prima gravidanza “in provetta” al mondo sia stata ottenuta mediante la fecondazione di un solo ovocita ottenuto su ciclo spontaneo, il successivo impiego di farmaci per l’induzione della crescita follicolare multipla ha permesso di migliorare significativamente i risultati clinici.⁽¹⁾

Tuttavia, non ci sono risultati univoci e la discussione è ancora aperta per quanto riguarda l’effetto dei vari tipi di gonadotropine sul reclutamento follicolare, sulla qualità ovocitaria, sulla competenza embrionaria e quindi sui tassi di gravidanza.⁽¹⁾

Ovociti e fertilità femminile

Le cellule riproduttive femminili (ovociti), a differenza di quelle maschili (spermatozoi), si formano prima della nascita, durante lo sviluppo degli organi genitali. Nel corso della vita questa "riserva ovarica" si riduce poi progressivamente ogni mese fino ad esaurirsi del tutto (comparsa della menopausa). Ogni donna nasce con 1-2 milioni di follicoli e alla pubertà ne rimangono 500.000. Solo 500 di questi escono dall’ovaio e gli altri si distruggono.⁽²⁾

Il sistema riproduttivo femminile dipende dal ciclico reclutamento follicolare, dalla selezione di un unico follicolo dominante, dall’ovulazione e dalla formazione del corpo luteo. Se la fecondazione e di conseguenza l’impianto non avvengono, il corpo luteo scompare, l’endometrio si sfalda e compare la mestruazione.⁽²⁾

Quali sono i criteri per selezionare un ovocita rispetto ad un altro secondo un’importante analisi della Società Italiana della Riproduzione (SIR)?

Una corretta ossigenazione

Gli ovociti provenienti da follicoli con un contenuto di ossigeno maggiore del 3% offrirebbero migliori tassi di fecondazione e di sviluppo embrionario.⁽¹⁾

Un’adeguata velocità

È stato riportato un incremento dei tassi di gravidanza nei casi in cui vengano trasferiti embrioni derivanti da follicoli che presentano una velocità massima di picco >10 cm/sec.⁽¹⁾

Una maggiore vascolarizzazione

L’entità della vascolarizzazione follicolare può rappresentare un importante parametro clinico di selezione follicolo-ovocitaria. La possibilità di identificare i follicoli maggiormente vascolarizzati da cui prelevare gli ovociti, permetterebbe di ridurre il numero di embrioni da trasferire, riducendo al massimo il rischio di gravidanze multiple senza diminuire i tassi di gravidanza. Tuttavia, da un punto di vista tecnico questa misurazione non risulta molto agevole durante il prelievo ovocitario, perché comporta un notevole aumento dei tempi di esecuzione dell’intervento e aumenta di conseguenza anche il disagio per la paziente.⁽¹⁾

Maturità degli ovociti

Un primo livello di selezione si basa sulla maturità nucleare ovocitaria. Alla nascita gli ovociti sono bloccati al primo stadio di maturazione (Profase) e sono caratterizzati dalla presenza di una struttura nucleare chiamata vescicola germinale (VG).
Al momento del prelievo ovocitario la maggior parte degli ovociti si trova invece ad uno stadio di maturazione ottimale per la fecondazione (Metafase II). Mentre una percentuale variabile di essi, dal 10 al 20%, resta allo stadio VG o allo stadio di Metafase I, ossia una condizione non di piena maturazione.
Una percentuale compresa tra il 30 e il 70% degli ovociti Metafase I matura in-vitro e raggiunge in alcune ore lo stadio di Metafase II. Questi ovociti maturati in-vitro hanno ridotte percentuali di fecondazione ma simile qualità embrionaria rispetto agli ovociti Metafase II. Invece gli ovociti che al momento del prelievo ovocitario si trovano allo stadio di VG normalmente vengono eliminati.⁽¹⁾

Citoplasma ovocitario senza anomalie

Oltre alla valutazione dello stato meiotico è importante andare a valutare l’aspetto morfologico del citoplasma ovocitario, in quanto spesso circa la metà degli ovociti prelevati presentano almeno un’anomalia morfologica. Poiché, non esiste una univocità di risultati per quanto riguarda l’effetto di queste anomalie del citoplasma sull’outcome clinico, alcuni hanno proposto l’impiego combinato di tre markers quali le caratteristiche del corpo polare, le dimensioni dello spazio perivitellino e le inclusioni citoplasmatiche, per individuare con più accuratezza gli ovociti dotati di maggiore potenzialità evolutiva.⁽¹⁾

Morfologia del fuso meiotico

Il fuso mitotico o meiotico è l’apparato cellulare che permette la divisione dei cromosomi nel corso della mitosi e della meiosi. La divisione cellulare si verifica a causa della bipolarità del fuso, costituito da due gruppi di polarità opposta, disposti intorno ai cromosomi. Grazie ai fusi i cromosomi possono essere trasportati e guidati come funi sino al polo verso il quale sono rivolti e dal quale si originerà la cellula figlia.⁽³⁾

L’integrità del fuso meiotico negli ovociti in Metafase II è di fondamentale importanza per una normale fecondazione ed un corretto sviluppo embrionario. Pertanto, in aggiunta agli altri criteri morfologici ovocitari, può risultare utile, al fine di selezionare il “miglior” ovocita, analizzare la morfologia del fuso meiotico.⁽¹⁾

Il fuso meiotico è infatti visibile in circa il 90% degli ovociti secondari e la mancata sua visualizzazione è associata ad un più basso tasso di fecondazione e di sviluppo embrionario.⁽¹⁾

I limiti di questo criterio sono insiti nella struttura del fuso meiotico che risulta essere altamente sensibile a modificazioni chimico-fisiche che si possono verificare durante la manipolazione ovocitaria. Inoltre, anche parametri come l’età materna avanzata e la permanenza eccessiva in vitro dell’ovocita dopo che è stato prelevato sono associati ad una alterazione della sua architettura.⁽¹⁾

Analisi cromosomica del primo corpo polare

Un altro metodo, molto più complicato rispetto a quelli descritti finora, per cercare di selezionare il "migliore" ovocita è l'analisi genetica del primo corpo polare.⁽¹⁾

Quando l'ovocita primario completa la sua prima divisione meiotica, i cromosomi si suddividono in modo uniforme ma questo non avviene con il citoplasma, che si concentra per la maggior parte in una delle due cellule figlie (chiamata ovocita secondario) e rimane in piccole quantità nell’altra che viene chiamata corpo polare. Il corpo polare non è un ovocita funzionale, ma degenera e muore. La sua formazione consente all'ovocita primario di ridurre il suo genoma della metà e conservare la maggior parte del suo citoplasma nell'ovocita secondario.⁽⁴⁾

La tecnica di selezione ovocitaria basata sull’analisi cromosomica del primo corpo polare, si basa sul principio secondo il quale tale corpo costituisce un'immagine speculare dell'ovocita. Una volta prelevato, il primo corpo polare viene trattato specificamente per poterne analizzare il materiale genetico. I cromosomi normalmente analizzati sono quelli maggiormente coinvolti nelle trisomie e negli aborti spontanei (X, Y, 13, 15, 16, 18, 21, 22).⁽¹⁾

L'analisi genetica del primo corpo polare, se confrontata con quella eseguita sull'embrione, ha il vantaggio di consentire la selezione degli ovociti prima della fecondazione e inoltre non comporta la selezione di embrioni che presentino anomalie cromosomiche. Tuttavia, questa tecnica presenta una serie di limiti rilevanti rispetto alla diagnosi genetica effettuata sugli embrioni, tra cui il fatto che è applicabile solo in caso in cui la patologia genetica sia di origine materna.⁽¹⁾

Conclusioni

Secondo la Legge 40, la selezione ovocitaria deve essere quella dei 3 migliori ovociti da inseminare in base ai soli criteri clinici e morfologici, la cui correlazione con gli esiti clinici è ancora da dimostrare. Da un punto di vista clinico sono incoraggianti i risultati riportati dalla ricerca sulla correlazione tra vascolarizzazione del follicolo e potenziale di sviluppo dell'ovocita corrispondente: follicoli maggiormente vascolarizzati conterrebbero ovociti con maggiore potenziale di fecondazione e di sviluppo embrionario. Recentemente, la possibilità della valutazione del fuso meiotico ha offerto inoltre un altro criterio di selezione ovocitaria. Tuttavia, tutti questi metodi proposti necessitano di ulteriori studi per valutare la loro reale efficacia.⁽¹⁾